RIA
RIA (Radioimmunoassay) adalah salah satu teknik immunoassay yang lebih baik dan lebih sensitif. Pada dasarnya, semua prinsip-prinsip desain assay EIA didasarkan pada kesimpulan yang diambil dari penggunaan RIA. Meskipun RIA masih merupakan teknik yang layak, namun sebagian besar telah digantikan oleh CL dan EIA di sebagian besar laboratorium klinis. Berbagai radioisotop dimanfaatkan dalam pemeriksaan RIA, I125, H3, C14. Baik CL dan EIA memiliki keunggulan pada reagen yang lebih stabil dan dapat memiliki batas deteksi yang lebih sensitif, serta tidak ada masalah dengan pembuangan limbah berbahaya.
FIA
FIA menggunakan fluoresens sebagai pendeteksi. Metode ini dapat digunakan baik dalam pemeriksaan homogen maupun heterogen. Fluoresens sendiri merupakan pancaran foton cahaya yang berwujud electron yang bergerak dari daerah pemicu loncata electron ke daerah netral. Sistem ini membutuhkan sumber cahaya pemicu loncatan electron, penyaring pancaran cahaya, dan sistem deteksi menggunakan tabung cahaya yang memiliki pengait. Lampu merkuri lebih sering dipergunakan sebagai sumber cahaya, meskipun xenon, halogen, dan laser dapat dipergunakan.
Fluoresens isothiosianat dan rhodamin merupakan fluoresens yang popular. FIA memiliki banyak unsur penyusun yang memiliki fungsi khusus sehingga FIA menjadi pemeriksaan khusus.
Ada sejumlah pemeriksaan homogen yang dilakukan dalam fase cair dan tidak membutuhkan pemisahan pengikat dengan komponen bebas. Salah satu teknik homogeny yang popular adalah Fluoresence Polarization Immunoassay. Teknik ini memberikan angka perbandingan antara pengikat dengan komponen bebas yang terlibat dalam reaksi tanpa membutuhkan tahapan pemisahan antara pengikat dan komponen bebas.
Polarisasi cahaya diukur dengan cara menyinari sampel menggunakan dua polarizer pada bidang yang sama dengan bidang cahaya masuk dan kemudian pada bidang yang telah diatur dalam posisi 90° antar bidang dengan sampel. Pengujian ini didasarkan pada peningkatan polarisasi cahaya yang terjadi ketika antigen fluoresen tag mengikat antibodi dan membentuk komplek imun. Antigen yang diberi label berukuran kecil sehingga dapat berputar cepat. Putaran cepat inilah yang menyebabkan depolarisasi cahaya. Ketika komplek antibodi antigen terbentuk, kenaikan berat molekul menyebabkan rotasi lebih lambat dan peningkatan emisi cahaya yang terpolarisasi. Teknik ini terutama biasanya digunakan untuk pengukuran obat dan beberapa hormon, bagaimanapun, ia memiliki utilitas untuk mendeteksi penyakit menular. Penggunaannya telah dijelaskan untuk mendeteksi antibodi berbagai organisme seperti bakteri gram negative (Brucella sp dan Salmonella sp) dan virus yang menyebabkan anemia pada kuda. Ada beberapa varian tes homogen dan heterogen. FIA memiliki sejumlah keunggulan termasuk kepekaan dan kecepatan tinggi dan sensitif seperti RIA. Selain itu, reagen stabil dan penggunaanya mudah dilakukan. Fluorecens polarization immunoassay memiliki keterbatasan berupa antigen yang harus kecil (tidak lebih dari 2000 MW) untuk memungkinkan perbedaan yang signifikan dalam polarisasi ketika membentuk komplek imun. Kekurangan lain yang juga penting digarisbawahi dalam penggunaan assay fluoresensi adalah masalah senyawa autufluorescent yang digunakan baik dalam sampel pasien maupun dalam campuran reaksi. Ini bisa menjadi masalah yang bermakna dalam uji homogen di mana tidak ada tahapan pencucian dan komponen sampel yang ada dalam tes. Untuk menghindari masalah ini, sampel dapat ditambah dengan enzim proteolitik, agen oxida, atau reagen denaturasi yang akan membatasi jumlah autofluorescence. Dalam uji fase padat, sebagian besar zat yang terlibat akan terhapus dari reaksi.
CL IMMUNOASSAY
CL immunoassay adalah teknik yang sangat populer yang secara luas digunakan dalam berabagai bentuk tes yang berbeda. CL adalah emisi cahaya yang terjadi ketika substrat mengalami peluruhan dari keadaan tereksitasi ke keadaan dasar. Berbeda dengan reaksi FIA yang menggunakan radiasi yang terjadi sebagai sumber energi, energy CL berasal dari reaksi kimia yang terjadi, yang paling sering adalah reaksi oksidasi. Pemeriksaan ini merupakan salah satu pemeriksaan yang paling sensitif dari semua immunoassay dengan batas deteksi sampai tingkatan attomole (1018 ) atau tingkat zeptomole (1021 ). Substrat CL digunakan sebagai titik akhir baik pada uji homogen maupun pada uji heterogen, di samping penggunaannya dalam imunoblotting dan deteksi multianalis. CL digunakan sebagai label langsung terhadap antigen atau antibodi dalam suatu reaksi yang dikatalisis dengan menambahkan substrat untuk enzim berlabel immunoreactant. Ester acridinium merupakan label yang paling sering digunakan, adalah turunan dari isoluminol dan ester acridinium. Yang terakhir adalah label yang popular, yang paling sensitif dan banyak digunakan. Hal ini dapat terkonjugasi pada antigen dan antibodi dengan menggunakan teknik standar. Deteksi relatif sederhana dengan penambahan natrium hidroksida dan hidrogen peroksida. Hasil reaksi yang berwujud kilatan cahaya, dibaca dengan menggunakan sebuah luminometer. Selain itu, sinyal cahaya dapat direkam pada film fotografi.
WESTERN BLOT DAN IMMUNOBLOT
Western Blot dan imunoblot adalah dua tahap uji padat yang menggabungkan pemisahan protein dengan menggunakan pemisahan dengan denaturasi gel elektroforesis yang diikuti dengan transfer ke filter dan penentuan reaktivitas dari serum pasien dengan protein individual yang terpisah, menggunakan ELISA sandwich. Imunobloting menggunakan filter membran padat yang mengandung antigen diidentifikasi oleh reaksi spesifik dengan antibodi. Umumnya teknik ini digunakan untuk mengidentifikasi pola spesifik antibodi ke berbagai agen penyakit menular. Salah satu aplikasi yang umum digunakan adalah konfirmasi terhadap antibodi terhadap HIV. Pola imunobloting dapat dibaca secara visual menggunakan isotop radiolabel atau menggunakan substrat CL yang kemudian dikembangkan pada sinar X, film fotografi atau kamera yang digabungkan
IPCR
IPCR adalah teknik baru yang menggabungkan ELISA tradisional dengan PCR. Menggunakan antibodi berlabel langsung dengan asam nukleat. IPCR adalah teknik ultrasensitif yang telah digunakan untuk mendeteksi berbagai virus. Ia memiliki keuntungan karena mampu mendeteksi protein prion di mana tidak ditemukan asam nukleat. Selain itu tehnik ini dapat mendeteksi protein virus tanpa mendeteksi asam nukleat. Tehnik ini tercatat sebagai tehnik deteksi ultrasensitive yang memiliki kemampuan mendeteksi berbagai agen infeksi seperti Streptococcus, HIV, Rotavirus dan sebagainya. Pada kasus Rotavirus dilaporkan bahwa IPCR dapat mendeteksi paling tidak 100 partikel virus/ml, hal ini dibandingkan deteksi oleh ELISA sebesar 100.000 partikel/ml. untuk mendeteksi antigen p24 HIV, IPCR sangat sensitif. Meskipun sangat sensitif namun ada persoalan di IPCR, terutama saat mengkombinasi asam nukleat ke protein da nada persoalan dengan dasar tes yang tinggi. Pendekatan alternative menggunakan DNA untai ganda yang secara tidak langsung untuk alkali fosfat. Selain itu juga dikemukakan bahwa metode ini dapat dipergunakan di masa depan dengan tingkat penggunaan yang tinggi.
Rapid Immunoassay
Pembuatan berbagai immunoassay yang cepat telah merubah tes diagnosa terutama pada berbagai laboratorium dan dapat digunakan tidak kurang dari 30 menit untuk mendapatkan hasil. Ada berbagai macam tes yang dapat mendeteksi antigen dan antibody debgan cara amplifikasi asam nukleat. Salah satu dari jenis tes ini yang cukup terkenal adalah lateral fluoro immunoassay atau immunochromatography. Tes ini memiliki keunggulan sebagai tes yang bekerja satu langkah. Di dalam alat ini terdapat kromatografi yang terbagi atas tiga zona, yaitu zona aplikasi sampel, zona konjugasi, dan zona penangkap.
Area konjugasi menggunakan berbagai macam konjugat seperti koloid emas, bahan celup ataupun butiran latex, untuk menghasilkan sinyal. Sampel diletakkan pada ruang sampel p\ dan mengalir menyamping akibat aksi kapiler. Ketika mencapai daerah konjugasi yang disusul adanya analyt, akan berikatan dengan dengan konjugat, membentuk kompleks imun. Kompleks ini akan meneruskan aliran ke lateral sepanjang blok dengan tetap dipengaruhi oleh aksi kapiler dan akhirnya akan ditangkap oleh antibody ke-2 atau antigen yang mengimpregnasi dalam area penangkapan. Jika ditemukan garis berwarna maka tes tersebut bereaksi positif. Terdapat pula kontrol positif untuk memastikan bahwa alat berfungsi baik. Ada beberapa variasi pada tes yang tidak membutuhkan venipungtur yang terpisah, penggabungan antara pengumpul sampel dengan pengetes dalam satu tes. Selain itu ada rapid tes bernama dot blot immunoassay. Tes dot blot ini sangat bermanfaat untuk tes HIV di negara tertinggal.
Secara keseluruhan immunoassay sangat mudah dan sederhana sehingga dapat dipergunakan di lapangan kerja serta dapat dioperasikan oleh tenaga medis dengan keterampilan minimal. Persoalan yang muncul dengan rapid test mencakup fakta bahwa alat ini tidak dapat otomatis, interpretasinya subjektif, dan hasil tes salah karena tenaga operator bukan tenaga ahli yang dididik tentang laboratorium secara formal. Akan tetapi mengingat seluruh keuntungan dan harga yang lebih murah, penggunaan alat ini akan berlanjut.
Teknologi Otomatis
Dengan tersedianya EIA, daftar alat-alat analisa otomatis meningkat jumlahnya. Saat ini tercatat 36 immunoassay yang dapat digunakan dengan spectrum luas untuk mendeteksi penyakit infeksi telah tersedia. Mesin-mesin ini digunakan pada seluruh tes serologi (baik determinasi antigen maupun antibodi) penyakit infeksi seperti HIV, hepatitis (A, B, dan C), Toxoplasma gondii, infeksi cytomegalovirus, rubella, dan infeksi Chlamydia trachomatis. Banyak sistem pada mesin ini membutuhkan teknologi yang terbatas. Kadang pula menggunakan sistem robotic yang lebih efektif terutama untuk laboratorium rumah sakit kelas menengah.
Banyak alat laboratorium yang mempergunakan kombinasi teknologi dan secara cepat serta simultan mendeteksi sampel tunggal. Berbagai alat tersebut termasuk CL, FIA, flow cytometry dan diagnostic molekuler (PCR dan penggunaan oligonukleotida serta nanopartikel). Teknologi ini hanya membutuhkan sampel dalam jumlah yang sedikit, secara luas diaplikasikan pada studi epidemic dan percobaan vaksin. Tes ini juga berguna untuk menilai agen biologis dari berbagai sampel.
Dengan hadirnya tes yang mudah dikerjakan menggunakan sistem otomatis, maka potensi adanya prosedur tes yang tidak tepat ataupun interpretasi serta hasil yang salah akan meningkat. Hasil tersebut akan memebrikan tekanan pada pekerja laboratorium dan spesialis infeksi untuk memnyediakan informasi baik pada kolega ataupun pasien tentang hasil yang sebenarnya, dan interpretasi yang tepat dalam rangka menegakkan diagnose penyakit infeksi.
